即時聚合酶鏈式反應（Real-time polymerase chain reaction）是一種在DNA擴增反應中，以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應（PCR）循環后產物總量的方法。此實驗法已被眾多科學家采用，因為其偵測范圍廣、靈敏度高、準確、專一及快速。PCR的發展因為偵測感染病患的病毒（不過RNA病毒須先逆轉錄成DNA才進行PCR）或細菌量、癌癥監測、診斷個別基因差異的用藥反應等應用而大幅提高。

       麥克林提供即時聚合酶鏈式反應實驗相關試劑，具有純度高、生產工藝先進、接受研發定制等特點，能被廣泛適用于各類科研項目，研究實驗中，歡迎選購。

Taq DNA聚合酶的結構

      本文通過以下幾點介紹麥克林即時聚合酶鏈式反應實驗中的技術步驟、反應比較及相關產品：

       1.染劑

       2.反應儀器

       3.數據分析

       4.實驗應用

       5.實驗比較

       6.麥克林即時聚合酶鏈式反應相關試劑介紹

染劑

       使用于PCR偵測的化學物基本可分為兩類：非專一性化學物，通常是與DNA結合的螢光染劑；目標專一性化學物，是使用螢光探針或引物。

       非專一性偵測：SybrGreen、HRM(High Resolution Melt)

       目標專一性偵測：TaqMan probe、Molecular Beacon、LightUp、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)

        TaqMan probe 是選取PCR上下游引物之間的一段序列作為探針，并在探針的5`-端標記上熒光基團，3`-端標記上相應的淬滅基團(由于兩個基團靠得很近，構成熒光能量傳遞的關系，沒有熒光信號產生，在每一個循環的黏合(annealing)過程中，該探針可以與模板相結合，隨后的延伸反應中，當引物合成至探針與模板結合處時，Taq酶的5`-外切酶活性可以降解探針的5`-端，并因此使熒光基團與淬滅基團分離，釋放熒光，理論上每合成一次新鏈就有一次熒光信號釋放)。

        Molecular Beacon 是探針片段在游離狀態下呈莖環(stem-loop)結構，其中莖的部分一般是5至7個高GC含量的核苷酸，環的部分是15至30個可以與PCR模板互補的核苷酸序列，而且探針的5`-端和3`-端分別標記有熒光報告基團和淬滅基團(由于這兩個基團處于莖的結構中，靠得很近，沒有熒光信號產生，在PCR每一個循環的變性過程中，處于莖環結構的探針被打開，并在黏合過程中與模板結合，使螢光基團遠離淬滅基團并釋放熒光信號，因而熒光強度與被擴增的模板量成正比)。

反應儀器

        1.光源：氙氣燈、激光、發光二極管（LED）

        2.濾鏡

        3.偵測方式：光電倍增管（photomultiplier tube, PMT）、光電耦合元件（charge-coupled device, CCD）、光電二極管（photodiodes）

        4.控溫方式：熱電效應元件（peltier elements）、旋轉式氣流升降溫、微流體式

        5.容器：聚丙烯（PP）容器、玻璃毛細管

數據分析

        1.門檻循環（MIQE中定義為Cq值(quantification cycle)；過去通稱為Ct, Threshold cycle，Ct值，又稱閾值循環數）

        2.解離曲線分析（melting curve）

        3.高分辨率解離分析（High Resolution Melt, HRM）

        4.FRET分析

實驗應用

       PCR的一些應用包括：

       1.基因表達分析：例如結核分岔桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是一種生長相當緩慢的細菌，傳統培養及鑒定一般需要花數周時間，但2015年時Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己發展的real time PCR檢測mpt64，直接檢測病人痰液中的結核分岔桿菌，分析715個檢體657個病人，其檢測靈敏度（sensitivity）及特異性（specificity）分別為90.3%及98.6%，而傳統培養方法的靈敏度及特異性分別為90.3%及99.7%。整個實驗流程可以在5個小時內完成，此方法可以用于沒有套裝試劑（kit）可以使用的實驗室。

       2.檢驗生物芯片的結果

       3.siRNA與miRNA診斷

       4.基因型鑒定

       5.獸醫微生物檢測

實驗比較

      qPCR的特點

       熒光實時定量PCR的基本原理有兩個要點：首先是對PCR反應中的每一個循環的反應產物進行實時檢測并記錄下來；其次，用于檢測PCR產物實時檢測的熒光染料標記在一段可以與單鏈PCR產物(模板)特異性雜交的探針上，并且處于淬滅狀態，只有當探針與模板特異性結合以后才有可能釋放出熒光信號。

       每一輪循環中PCR的產出量都以熒光信號的形式被PCR儀的光學檢測系統記錄下來，在某一循環中熒光信號的強度達到預先設定的閾值時，此時的循環數稱為CT(Threshold Cycle)，Ct值與起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，達到閾值的循環數就越少，換句話說CT值會越小。如果要確定量的話，需要做出標準曲線，以Ct值為縱坐標，起始模板數為橫坐標作圖。在新的MIQE規范中Ct這個慣用的名詞被重新定義為Cq值(quantification cycle)。

      和PCR比較

       常規PCR的產物在理論上呈指數級增長，而在實際反應中，由于反應物濃度、酶活性等條件的變化，在循環數不斷增加時，反應進入平臺期，PCR產物不再呈指數級增長。熒光實時定量PCR的優點在于它避免了常規PCR的平臺效應對起始模板量和最終產物量之間相關性的干擾。

       專一性探針的優點是只有正確的擴增產物才能和用于定量的探針結合并產生熒光信號，這樣就避免了假陽性污染，對于臨床診斷等工作特別有效。但相對來說，合成螢光探針的價格較于昂貴，不利于小規模的實驗檢測；因此在研究型實驗室還是以SYBR Green的非專一型qPCR為主要選擇。

      普及性

       因為價格、耗材較貴的因素，qPCR多了光學配件及螢光物質的費用，在普及度上qPCR的機器較PCR機臺少。

聚合酶鏈鎖反應簡圖：1.變性→2.退火→延伸

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